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测序周报·科研篇:CRISPR之父张锋最新综述

时间:2017-1-11 17:59 ( )
摘要:本周关注:CRISPR之父张锋最新综述 摘要: 宿主-病原体之间的军备竞赛,是生命进化中的普遍且核心的一面。大多数生物在进化中发展出了多重不同但相互作用的抗病原体防御策略,包括对寄生生物侵袭的抵御,先天和适应 ......

本周关注:CRISPR之父张锋最新综述

摘要:

宿主-病原体之间的军备竞赛,是生命进化中的普遍且核心的一面。大多数生物在进化中发展出了多重不同但相互作用的抗病原体防御策略,包括对寄生生物侵袭的抵御,先天和适应性免疫以及程序性细胞死亡(PCD)。 PCD是对付感染的最后的手段——当抵抗和免疫失败时被激活的自杀反应。受感染的细胞要在两个选择之间做出决定:是主动防御还是利他主义的自杀/或是休眠诱导,这取决于免疫是否被认为能够防止寄生生物繁殖和随后感染其他细胞。在细菌和古细菌中,免疫基因通常与PCD模块共定位,类似毒素-抗毒素,提示免疫-PCD偶联可能由共享蛋白质介导,这类共享蛋白质可能感测损伤和预测感染的结果。在VICRISPR-Cas系统中,在免疫和PCD整合的情况下,负责灭活靶RNA的相同的酶有可能也负责执行细胞自杀。

前言:

寄生是所有生命复制系统的内在组成部分[1-3]。几乎没有细胞生命形式可以排除寄生的遗传元素[4-6],大多数生物体会成为各种不同类别元素如病毒,转座子和质粒等的宿主[7]。因此,整个生命历史可以看做是一个寄生生物和宿主之间不断进行的武器竞赛的故事,其间双方演变了各种进攻,防御和反防御战略[1,2,8]。几乎所有的细胞生命形式——除了一些细胞内寄生细菌——都发展出并结合多个抗寄生物防御机制[9]。主要的防御策略包括:(i)抵抗——某个特定寄生生物(例如病毒)的受体发生突变,成为不利于寄生物进入宿主细胞的形式; ii)先天免疫,即主动防止不同寄生生物繁殖的多种机制; iii)适应性(获得性)免疫,其中涉及收集关于特定寄生虫的信息和利用该信息以高效和选择性地阻断其繁殖的机制;和(iv)程序性细胞死亡(PCD)(以及可能更广泛地,有机体的程序性自杀),这是受感染的细胞发起自我破坏程序,阻断寄生生物繁殖过程的完成,从而保护其他细胞免于感染[9 -11]。在细菌中,引起PCD的功能系统在许多情况下也可以诱导休眠状态——即以非常低的代谢活性为特征的非复制性细胞状态[12-14]。随着充分认识休眠的重要性并研究其相关过程,我们在下文中会大体涉及PCD系统和机制,包括休眠诱导。在某种意义上,PCD是先天免疫的一种形式,因为自杀反应可以由不同的病原体没有选择性地触发的。然而,鉴于免疫反应(其中细胞生物体杀死或灭活病原体)和PCD能引起细胞(还可能包括多细胞生物体)杀死自身)之间的基本生物学差异,因此我们将这些策略视为不同的策略。

最近由古生菌和细菌中的CRISPR-CasClustered Regularly Interspaced Palindromic RepeatsCRISPR相关基因)系统介导的适应性免疫的发现,已经引起了极大的关注和兴趣[15-18]。无疑地,这种热情高涨很大程度上是由于IICRISPR-CasCas9)能够作为基因组编辑和调节的新一代工具[19-23]。然而,CRISPR-Cas系统也具有重要且基本的生物学意义。并且值得注意的是,这些免疫系统的独特机制使得它们成为简单易行的基因组工程工具。可以说,CRISPR-Cas功能的最引人注目的方面是:这是唯一已知的具有可遗传的基因组记忆的适应性免疫的例子——即拉马克的适应性特征遗传的机制[24]。尽管CRISPR-Cas应答的一些步骤似乎涉及选择机制,但主要的拉马克趋势是显而易见的,因为CRISPR-Cas系统修饰基因组中的特定基因座,使之获得了独特的表型改变(对特定病毒或质粒的免疫)然后跨代传播(在某些情况下,可能是数百万子代)[25]

CRISPR-Cas的发现刺激了对原核防御系统的原理和作用机制的广泛研究。在这个过程中,免疫和PCD之间的多重、复杂的联系已经很明显,导致出现了两种类型的防御之间的功能耦合的概念[26,27]。在这里我们讨论这种关联的不同方面,其中重点关注最近的发现:有迹象表明是一些防御系统,免疫和PCD能有效合并。

免疫系统具有内在的自杀潜力

PCD是利他主义自我毁灭的专用机制,即使除了这种程序性死亡,免疫机制本质上也是自杀式的。简化考虑能使这一点很明显。免疫是一系列机制的集合,用于破坏寄生生物并终止其繁殖——包括各种可移动的遗传元件,如病毒。考虑到遗传系统在所有生命,细胞或病毒中的基本统一性,从设计上来看,免疫性是危险的,因为它不可避免地攻击宿主本身,除非始终保持检查。在最一般的意义上,这是热力学定律的结果,它不允许没有相应的能量消耗的无误差信息传输[28,29]。许多往往具有毁灭性的自身免疫性疾病是一个明显的例子[30,31]。此外,CRISPR-Cas系统的自身免疫已被证明[32-34],符合它是免疫系统不可分割的一部分的观点。因此,免疫系统只有当伴随有效的自我/非自我识别机制才能得以维持,而这种自我/非自我辨别是随着免疫本身而不断进化的。这在什么情况下会发生呢?当保护自我防御寄生生物的利益更大时,和/或当免疫系统本身具有自私元素的性质并变得对宿主成瘾时,如本节后面所述。

自我/非自我识别的原则在先天免疫与获得性免疫之间存在很大差异,这些区别反映了这两种免疫之间的主要差异。先天免疫系统能识别自我的通用属性,经常是这些系统本身引入的修饰。许多,高度多样和丰富的限制修饰(RM)系统可能是最明显的例子[35-38]

最常见的RM模块(称为II型)由两种蛋白质组成,其中一种是甲基转移酶,其负责自身的修饰(甲基化);另一种蛋白质,核酸酶,靶向和破坏所有未修饰的DNA,从RM的角度来看相当于非我部分(在RM系统中这个方面有非常多的错综复杂的变化,我们没有机会在这里描述)。

RM系统与典型的毒素-抗毒素(TA)模块有很相似的关键特征,在原核生物中专用的PCD诱导物比RM更丰富[9,39,40]。在RMTA模块中,都有模块的一部分扮演毒药,而另一部分扮演解毒剂。这两类系统之间的相似性非常明显,有时它们被一起被分类为毒素-抗毒素[41]。然而,与专用自杀系统相比,毒药和解毒剂在免疫系统中的功能不同(图1)。在免疫系统中,毒物(例如限制性内切核酸酶)直接攻击外源DNA,而解毒剂(例如相应的甲基化酶)保护宿主基因组。相比之下,在专用PCD系统中,毒物针对重要的宿主分子——例如在TA系统的情况下的mRNA,这个系统中mRNA干扰酶作为毒素。抗毒素可逆地使毒素失活,从而保持两种组分之间的平衡。TA系统存在许多变化,其中抗毒素功能不同,例如,可通过灭活毒素mRNA [41-43]

 

1 免疫和程序性细胞死亡:不同但耦合的防御战略。通过甲基化保护宿主DNA不受限制酶的作用,而侵入的DNA则对限制酶是敏感的。先天免疫,以RM系统的形式,可以灭活寄生物DNA并阻断感染。然而,如果先天免疫失败(例如由于寄生物编码的对抗防御系统的活性)并且寄生物复制,则感染会诱导基因毒性应激,这个过程将激活蛋白酶切割抗毒素。而多余的毒素活化将导致休眠或PCD M,修饰酶; R,限制酶; T,毒素; A,抗毒素; MGE,移动遗传元件。

RM系统的自杀潜力是显而易见的:当宿主DNA的甲基化水平明显下降时,限制性内切核酸酶将杀死宿主。至少在一些RM系统中,通过与TA系统作用相似的质粒解离后致死系统(PSKpost-segregational killing system)已经证实了这种潜力:一旦RM系统从细胞中丧失,修饰甲基化酶的稀释导致甲基化不足而暴露的DNA被剩余的限制酶切割,从而导致细胞死亡[44-46]。其它RM模块在特定压力条件下会攻击自身DNA,特别是在复制叉[47,48]。此外,当噬菌体携带自身的甲基化酶在新位点甲基化宿主DNA,导致其被IV型酶识别为非自身时,IV型限制系统(不是RM,因为这些缺乏修饰组分)就变成自杀性的了[49] RMTA系统对宿主细胞具有成瘾性,因为在细胞分裂期间,当编码两种组分或仅抗毒素的基因丢失时,抗毒素迅速丧失活性(在RM的情况下为稀释,在TA的情况下为降解),并且通常,保留下来的足够的毒素足以杀死微生物细胞。综合起来,所有这些证据表明,尽管免疫显然是RM系统的主要作用模式,但它们不仅偶然会自杀或嗜质粒解离后致死,而且在各种不同情况下,实际上会转变为PCD机制。鉴于它们的成瘾性和频繁以质粒形式转移,RMTA系统可以被认为是一种特殊类型的移动遗传元件[50]

就自杀潜力而言,适应性免疫系统CRISPR-Cas似乎在这方面特别危险。实际上,CRISPR-Cas基因座整合入了独特的间隔区Spacer,用作识别和切割靶核酸的指导[17,18]。显然,通过这些引导件的自我识别——举例说,靶向Spacer本身——将是有害的并且可能是自杀性的。 CRISPR-Cas系统已经发展了针对这种直接自身识别的特异性保护,通常以序列基序(PAM,间隔子 - 相邻基序)的形式,这是原Spacer获取和后继识别所必需的,但在CRISPR中缺失,以这种方式阻止靶向自我[51-55]

然而,对于CRISPR-Cas系统易于发生的自杀性自身免疫的倾向来说,CRISPR阵列的直接自我识别只是自杀性自身免疫的一种形式。第二个涉及从宿主基因组获取spacers的明显可能性,随后是自杀性靶向[32-34]。仍然不清楚究竟CRISPR Cas系统是否能避免这种形式的自身免疫,以及如何避免。

在一个模型系统 - IE 亚型CRISPR-Cas中,已经证明实质性(尽管最有可能,不完全)的自身/非自我识别可通过识别正在进行RecBCD介导修复的主动复制的DNA实现[56 ]。然而,在另一个模型中,即II-A 亚型CRISPR-Cas,似乎没有这样的辨别机制:大多数细菌细胞被杀死,但是显然保护少数的益处超过了自杀行为的有害影响[57]

在原核生物中免疫和PCD机制的基因的共定位及其蛋白质的相互作用意味着功能偶联

除了免疫系统的自杀特征,编码这样的系统的基因组位点通常还包括专用的PCD模块,例如TA,并且,两种类型的防御系统会共享一些蛋白质(图2)。 CRISPR-Cas,原核防御系统重最复杂的一类,再次给出了最显著的例子。 CRISPR反应的第一个配对阶段Cas2的关键蛋白之一是mRNA干扰酶VapD家族毒素的衍生物[58,59] Cas2CRISPR-Cas中的主要作用是适配复合物的结构支架,其中Cas1是活性内切核酸酶组分[60-62]。干扰酶催化位点在一些Cas2蛋白(但不是所有)中是保守的,并且已经显示Cas2的催化残基对于适配不是必需的[60]。因此,至少在某些CRISPR-Cas系统中,Cas2可能作为RNase发挥次要作用,可能是作为毒素[26],尽管在大肠杆菌中过表达的Cas2蛋白的催化活性似乎没有毒性。事实上,几个Cas2蛋白针对DNARNA的非序列特异性核酸酶活性(但对RNA底物有一定的选择性)已经得到证明[63-67] Cas2的核酸酶活性在CRISPR-Cas功能中的作用仍然是模糊的,但是催化位点的进化保守意味着它在至少一些微生物中是功能性的。

 

2 在细菌和古细菌基因组中编码免疫和PCD系统的基因的共定位。预设操纵子中CRISPR-CasRMDND系统的核心基因由粉色箭头显示;具有(预设的)毒素活性的基因由不同的颜色显示,并且(预设的)毒素结构域由红色轮廓指示。 IA型系统中的Csa3蛋白缺乏HEPN结构域。 HEPN,高等真核生物和原核生物核苷酸结合结构域; Sir2ParBREaseDEDD,来自不同超家族的核酸酶。 ACRISPR-Cas基因座。基因名称遵循命名和分类从[16] B:限制性修饰基因座。基因名称遵循[94]的命名和分类。 C:硫代磷酸酯位点。基因名称遵循[95]的命名。 D:原核Argonaute基因,pAgo。转载自[26]创作共用许可证授权。

许多(即使不是大多数)CRISPR-Cas系统也含有额外的核酸酶,特别是HEPNHhigher真核生物和原核生物核苷酸结合结构域)超家族的(预设的)RNA[68,69](图2)。最近已经有实验证明这些蛋白质中的两种,Csm6Csx1的核糖核酸酶活性。通常,含有HEPNCas蛋白另外包含了能够接纳Rossmann折叠的CARF结构域,并且预测能结合配体(最可能的是核苷酸),并且执行信号传导功能[69]。值得注意的是,由CARFHEPN结构域组成的Csm6蛋白不是III-BCRISPR-Cas干扰所需的[70],表明该蛋白具有不同的辅助功能。 HEPN超家族由极多样(预测的)核糖核酸酶组成,其主要参与各种防御功能。特别值得注意的是,高度丰富的TA模块中包括含有HEPN结构域的蛋白作为毒素部分[68]。含HEPN结构域的系统在功能上仍然未知,但在许多原核生物中很常见,特别是在古细菌中有最丰富的TA模块[39,68]。因此,似乎可能的是,含HEPN结构域的Cas蛋白也具有毒素活性,这种毒素活性可以被相同蛋白的另一结构域或不同Cas蛋白所掩蔽。在一些CRISPR-Cas系统中,CARF结构域与和HEPN无关的预测核酸酶融合:特别是采用限制性内切酶折叠的Cas4同源物[69] CARF连接的核酸酶的这种明显的互换性表明一种有趣的可能性:它们都是通过CARF结构域的配体结合来进行调节的毒素。 


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